Electroforesis

El término electroforesis proviene de los vocablos griegos  “êlektron”  que significa “ámbar” y hace referencia a la electricidad y “phoros” que significa “llevar o trasladar”, por tanto etimológicamente puede definirse como un transporte o traslado bajo la acción de la electricidad. Más propiamente, la electroforesis se define como un método analítico para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.

En 1937 el bioquímico sueco Arne Tiselius dio a conocer un nuevo método para separar las proteínas de una mezcla. Éste consistía en colocar un cierto volumen de una solución de dos o más proteínas en un tubo de vidrio en forma de “U”, sin llenarlo completamente.  Después el espacio restante en cada extremo se ocupaba con el volumen necesario de una solución de electrolitos libre de proteína, que actuaba como amortiguador. Luego se sumergía un electrodo en la solución amortiguadora libre de proteína de cada extremo, se conectaban los electrodos a una fuente de electricidad y se sometía todo el sistema a un campo eléctrico. Los componentes de la mezcla de proteínas comenzaban a moverse a diferente velocidad  hacia el electrodo de carga opuesta. Se formaban frentes de movimiento que reflejaban la movilidad electroforética de cada componente, o grupos de componentes de la mezcla, por lo que se le dio el nombre de electroforesis de frentes en movimiento ” o “moving boundary electrophoresis” a este sistema.

http.pt7mdv.ceingebi.unam.mx/computo/pdf/met/electroforesis/Electroforesis/introducción/BoundaryElectr

Este fue uno de los pocos métodos analíticos poderosos disponibles para los investigadores en la época del desarrollo inicial de la química de proteínas y a pesar de que presentaba importantes desventajas como escaso poder de resolución, exigir gran cantidad de muestra,  ser muy laborioso y en la práctica no permitir la  separación total de los componentes de la mezcla, el sistema de Tiselius dio paso a aquellos que usaban un soporte sólido o gelatinoso, embebido en la solución amortiguadora de pH, sobre el que ocurría la separación electroforética y dadas las cantidades relativamente pequeñas de muestras que podían aplicarse, la separación total de los componentes en bandas o zonas discretas se convertía en algo realizable. Al desconectar el campo eléctrico, cada componente de la mezcla se mantenía por un tiempo suficiente para fines prácticos, en la zona del soporte que había alcanzado durante la electroforesis. Se les llamó genéricamente electroforesis de zona. 

Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas  en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir  cierto tiempo las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas negativamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo positivo).

El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará  este movimiento originando una fuerza que se opone, por otro lado  las moléculas poseen energía cinética propia por lo que tienden a moverse en forma aleatoria o movimiento browniano.  La suma de todas estas fuerzas provoca que las moléculas no migren de una manera homogénea, de tal manera que, si las moléculas son colocadas en un cierto lugar de solución, los iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura aumentara con el tiempo.

Para reducir la anchura de este frente se reduce el movimiento de las moléculas empleando un medio que le oponga resistencia, por ejemplo un gel. Éste es un polímero soluble de muy alto peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma un tamiz  que dificulta el movimiento de los solutos, consecuentemente, la migración electroforética de las moléculas será más lenta, pero el ensanchamiento del frente se verá reducido también. se aplica un potencial de corriente continua a través del mismo durante un tiempo fijo. Cuando las separaciones se han completado se interrumpe el paso de corriente y las especies separadas se tiñen para visualizarse.

ELECTROFORESIS LIBRE

En esta, el campo eléctrico se aplica a disoluciones o suspensiones. Históricamente, es el origen de la electroforesis tal y como hoy se conoce y fue desarrollada por Arne Tiselius en 1937. Actualmente está en desuso, ya que al ser un fluido el medio en el que se desarrolla, tiene poco poder de resolución.

ELECTROFORESIS EN ZONA

 Es una de las técnicas más utilizadas en bioquímica y biología molecular por su elevada resolución. El campo eléctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante (en vez de a un fluido) y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo.

Para llevar a cabo una separación electroforética zonal se necesitan:

• Fuente de alimentación. Proporciona el campo eléctrico mediante dos electrodos, uno positivo (ánodo) y otro negativo (cátodo) entre los que se establece una diferencia de potencial.
• Cubeta. Recipiente en cuyos extremos se sitúan los electrodos.
• Soporte electroforético.  

Cuando se utiliza la electroforesis en zona, la muestra se dispone inicialmente en una pequeña zona del soporte, y posteriormente lo va recorriendo impulsado por el campo eléctrico.
Para que esta situación sea estable, tanto al comienzo como a lo largo del proceso de separación, es necesario contrarrestar el efecto de la difusión y las posibles corrientes de convección. Para ello se utilizan reticulados moleculares (el soporte de la electroforesis), que forman un entramado tridimensional que impide o reduce dicha difusión y permite la entrada de agua en sus poros; el tamaño de estos poros debe permitir el paso de moléculas voluminosas como son los ácidos nucleicos y las proteínas. Además, el soporte debe ser inerte, es decir, no debe tener cargas que interfieran con la migración de las moléculas de la muestra. Los diferentes tipos de soportes se clasifican en dos grupos: Restrictivos y No restrictivos.

SOPORTES NO RESTRICTIVOS TIPO I

 El Tamaño de poro no opone impedimento al paso de las moléculas. El agar es el ejemplo más representativo y se obtiene a partir de algas marinas y está formado por dos tipos de polisacáridos: la agarosa y la agaropectina. La agarosa se utiliza ampliamente sobre todo para la separación de ácidos nucleicos y para el análisis de proteínas. Los diferentes tipos de agarosas se caracterizan por su punto de fusión (entre 35-95°C), su resistencia física y el grado de electroendósmosis.

SOPORTES RESTRICTIVOS TIPO II

Soportes Restrictivos Tipo II. El tamaño de poro opone resistencia al paso de las moléculas. El ejemplo característico son los geles de poliacrilamida, que no sólo evitan la convección y minimizan la difusión, sino que además participan en el proceso de separación. Estos geles son medios porosos en los que el tamaño de poro es similar al de las proteínas, de tal modo que existe un efecto de tamizado molecular y la separación electroforética depende de la densidad de carga de las moléculas y de su tamaño.

ELECTROFORESIS EN PAPEL

La muestra se aplica sobre una tira de papel filtro humedecido con una disolución tampón, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a separar y del pH del tampón. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes separados que contienen la disolución tampón y en los que se hallan colocados los electrodos.

Se conectan los electrodos a una fuente de tensión continua y se aplica una diferencia de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las moléculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel. La velocidad de emigración de una molécula, depende preferentemente de su carga. Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensión y se secan las tiras sobre una superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc.).

El revelado se realiza empleando los mismos métodos que los utilizados en cromatografía sobre papel, mediante la acción de los colorantes adecuados.
La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separación de sustancias de bajo peso molecular como aminoácidos y péptidos.

Las electroforesis en papel también pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa, que son químicamente más homogéneas y tienen la ventaja de ser transparentes, con lo que las sustancias a separar, una vez teñidas o reveladas, pueden cuantificarse por densitometría.
La principal aplicación es la separación de proteínas del suero o lipoproteínas, conociéndose el resultado como proteinograma y lipograma respectivamente. Se han aplicado también para la separación de isoenzimas de la lactato deshidrogenasa y la creatín-quinasa.

ELECTROFORESIS EN GEL

Un gel es un estado intermedio entre el sólido y el líquido. Este tipo de electroforesis se halla entre los métodos más resolutivos y convenientes empleados en la separación de macromoléculas. Los geles de uso más generalizado son: poliacrilamida y agarosa. Éstos poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y moléculas trasladadas durante el proceso electroforético. De esta forma, la separación no se produce sólo por las diferentes cargas de las moléculas, sino también por las diferencias de tamaño. Los geles están formados por un reticulado de polímeros (constituyendo una red enmarañada) y el líquido intersticial en el que se encuentra inmerso esta red.

Geles de agarosa

 La agarosa es un polisacárido (originalmente obtenido de algas) cuyas disoluciones (típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 ° C y formar un gel, semisólido al enfriarse. Este gel está constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras poliméricas embebida en gran cantidad de medio líquido, que retarda el paso de las moléculas, se usa usualmente para separar moléculas grandes de alrededor 20.000 nucleótidos.

Geles de poliacrilamida

Los geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) se forman por  polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible. Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.

La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis y caracterización de proteínas. La técnica permite separar moléculas cargadas y explota diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un campo eléctrico. Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel de poliacrilamida, que se pueden agrupar en dos categorías:

1. Electroforesis en gel en una dimensión (continuo o discontinuo)

• PAGE-nativa
• PAGE-desnaturalizante (SDS-PAGE)
• Isoelectroenfoque

2. Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

PAGE-NATIVA

La PAGE-nativa se utiliza para separar proteínas en condiciones no desnaturalizantes, por tanto, en función de la carga intrínseca de las mismas.

PAGE-DESNATURALIZANTE
                                                                                       
En la electroforesis desnaturalizante, como su propio nombre indica, se utilizan agentes desnaturalizantes de proteínas, como pueden ser: detergentes (p.ej. SDS, sodio dodecil sulfato), caótropos (p.ej. urea) y agentes reductores (2- mercaptoetanol, DTT). Para la visualización de las proteínas se utilizan diferentes métodos de tinción, siendo el más habitual el azul de Coomassie. En la SDS-PAGE, la separación es función del tamaño (masa molecular), lo que permite determinar el peso molecular de las proteínas. Para ello se compara la movilidad electroforética (Rf) de la proteína de peso molecular desconocido con el de proteínas de referencia de peso molecular conocido. La SDS-PAGE es muy útil para calcular el peso molecular de una proteína concreta ya que separa las proteínas según su tamaño.

ISOLECTROENFOQUE

Esta técnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa  en el desplazamiento de las moléculas en un gradiente de pH.  Las moléculas anfotéricas, como los aminoácidos, se separan en un medio en el que existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región del ánodo es Ácida y la del cátodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH  tal que las moléculas que se han de separar tenga su punto isoeléctrico dentro del rango. Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su punto isoeléctrico estarán cargadas positivamente y migraran hacia el cátodo, mientras aquellas que se encuentran en medios con pH más bajos que su punto isoeléctrico tendrán carga negativa  y migraran hacia el ánodo. La migración les conducirá a una región dónde el pH  coincidirá con su punto isoléctrico, tendrán una carga  neta nula y se detendrán.  De esta forma las moléculas amfotéricas se sitúan en estrechas bandas donde coincide su punto isoeléctrico con el pH.

ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

La electroforesis bidimensional se basa en separar las proteínas en una mezcla según sus dos propiedades moleculares, una en cada dimensión. El procedimiento más usado se basa en la separación en una primera dimensión mediante isoelectroenfoque y la segunda dimensión según peso molecular mediante electroforesis en poliacrilamida.

Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un método común y efectivo para la separación de moléculas, el proceso de separación puede durar varias horas, siendo difícil de cuantificar y automatizar.  La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación que se ha desarrollado gracias a los avances de la cromatografía líquida de alta eficacia junto con los procedimientos más tradicionales de electroforesis. Esta técnica permite separar bastante bien biomoléculas, donde la cromatografía líquida se muestra menos eficaz, y compuestos de pequeña masa molecular, difíciles de estudiar por los procedimientos clásicos de electromigración en soporte.
La electroforesis capilar constituye una adaptación particular de la técnica de electroforesis. Esta técnica separativa se basa en la migración de las especies de la muestra en disolución, portadoras de una carga eléctrica global, bajo el efecto de un campo eléctrico y en contacto con un soporte (medio de desplazamiento) adecuado.

En electroforesis capilar la tira se reemplaza por un tubo capilar abierto en sus extremos, fabricado con un diámetro pequeño (15 a 150μm). El capilar oscila entre 20 y 80cm, y está lleno de una solución buffer. Un detector se encuentra ubicado en un extremo del capilar, cerca del compartimiento catódico. La señal obtenida es la base de la obtención del electroferograma, que muestra el registro de la composición de la muestra. Solo las especies que se dirigen hacia el cátodo serán detectadas.

MÉTODOS DE DETECCIÓN

En la detección UV-Vis se mide la intensidad de la luz que pasa a través del capilar en una pequeña zona en la que se ha eliminado el revestimiento opaco. La detección por fluorescencia resulta más sensible si se emplea una fuente láser muy intensa, asociada a menudo a un procedimiento de preformación de derivados de los analitos portadores de un fluoróforo.

TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS CAPILARES

Electroforesis capilar en zona o en disolución libre (CZE)

Es el procedimiento de electroforesis más habitual, en el cual el capilar es recorrido por el electrolito a través de un medio buffer que puede ser ácido (fosfato o citrato), básico (borato), o anfótero (carácter ácido y básico). El flujo electroosmótico crece con el pH del medio electroforético.

Electroforesis capilar electrocinética micelar (MEKC)

En esta variante del procedimiento anterior se añade a la fase móvil un compuesto catiónico o aniónico para formar micelas cargadas. Estas pequeñísimas gotitas inmiscibles con la disolución retienen a los compuestos neutros de un modo más o menos eficaz, por afinidad hidrófila-hidrófoba. Se puede utilizar este tipo de electroforesis para moléculas que tienen tendencia a migrar sin separación, como es el caso de algunos enantiomeros.

Electroforesis capilar en gel (CGE)

Esta es la transposición de la electroforesis en egel de poliacrilamida o de agarosa. El capilar está relleno con un electrolito que contiene al gel. Se produce un efecto de filtración que ralentiza a las grandes moléculas y que minimiza los fenómenos de convección o de difusión. Los oligonucleótidos, poco frágiles, se pueden separar de este modo.

Isoelectroenfoque capilar (CIEF)

Esta técnica, también conocida como electroforesis en soporte, consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que contiene un anfótero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su punto isoeléctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presión hidrostática y manteniendo el campo eléctrico, se desplazan las especies separadas hacia el detector. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar péptidos con pI que apenas difieren entre sí 0.02 unidades de pH.

El resultado de una electroforesis depende de numerosos factores y es necesario conocerlos para lograr la máxima resolución.

CAMPO ELÉCTRICO

Es un gradiente de potencial que posibilita que haya electroforesis. A su vez, depende de diferentes parámetros:

• Diferencia de potencial (“V”). Se mide en voltios y es lo que define el campo eléctrico. Cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de migración. Las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la mayoría) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10.000 voltios.

• Intensidad (“I”). Se mide en amperios y cuantifica el flujo de carga eléctrica. Está relacionada con la diferencia de potencial por la Ley de Ohm:

y para una diferencia de potencial dada, su valor (normalmente entre 5-50mA) viene              determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en última instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las moléculas.

• Resistencia (“R”). Se mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor será la movilidad electroforética (ya que la intensidad ha de ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm). Depende de la naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y sección) y de la concentración del tampón de electroforesis.

• Temperatura. Por el efecto Joule, el paso de una corriente eléctrica produce calor, y este efecto será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia de potencial y la resistencia del sistema. Debe controlarse de forma estricta, puesto que puede afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte e incluso al equipo electroforético. Todo esto justifica, por sí solo, la necesidad de un sistema de refrigeración en las cubetas de electroforesis.

MUESTRA

La movilidad electroforética de una molécula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga y disminuye según aumenta su tamaño, ya que mayor es la fricción de la molécula con el medio y menor es su carga por unidad de superficie. Por esta razón, las moléculas globulares se mueven con mayor facilidad que las elongadas, ya que la esfera presenta la mínima superficie a igualdad de volumen. Así, moléculas del mismo tamaño y carga, pero de diferente forma, pueden tener una movilidad electroforética diferente y ser, por tanto, separables mediante una electroforesis.

TAMPÓN

Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua por acción del campo eléctrico, lo cual genera protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilo en el cátodo. El tampón es, por esta razón, esencial durante la electroforesis para evitar que el ánodo se acidifique y el cátodo se haga más básico, pero no debe afectar a las moléculas a separar.
Además, la fuerza iónica condiciona la movilidad electroforética de las substancias a separar, ya que influye en su esfera de solvatación y en la conductividad de todo el sistema, por lo tanto, es necesaria una fuerza iónica suficiente para mantener el pH y la conductividad durante todo el proceso, pero no muy elevada, ya que llegaría a interferir en el sistema.
Normalmente, se emplean tampones con fuerzas iónicas moderadas (0.05-0.10M), siendo el pH la característica que debe ser más controlada, puesto que determina la carga de la muestra.
Conviene señalar también que atendiendo a la distribución del tampón, los sistemas se clasifican en continuos cuando se emplea un único tampón en el proceso, y discontinuos cuando se emplean, al menos, dos tampones de pH y composición diferentes.

SOPORTE

 La simple presencia del soporte en una electroforesis hace que se presenten una serie de fenómenos de elevada trascendencia para el resultado del proceso:

• Adsorción. Es una retención inespecífica de las moléculas de la muestra sobre el soporte, por lo que afecta negativamente a la resolución, ensanchando las bandas de migración.

• Electroendósmosis (EEO). Es un fenómeno que se da en algunos soportes (sobre todo en los no restrictivos de tipo I), en los que aparecen cargas negativas, debidas a grupos carboxilo o sulfato, al estar en contacto con una disolución iónica.

Al aplicar el campo eléctrico, los iones y las moléculas se desplazan según su carga, pero en su migración se encuentran con un flujo de cationes desplazándose sobre la superficie del soporte y otro de aniones haciéndolo por el centro de los poros. Este flujo orientado se llama flujo electroendosmótico. El EEO va en contra de la resolución de una electroforesis, ya que las bandas de la muestra se ensanchan y se distorsionan; sin embargo, la EEO contribuirá a una mejor resolución en las inmunoelectroforesis y en la electroforesis

• Tamizado molecular. Es un efecto debido al mayor o menor reticulado de los soportes; cuanto más tupida sea la red de fibras, menores serán los poros. El movimiento de las moléculas a través del soporte es más o menos fácil en función de su tamaño respecto al de los poros; aquellas moléculas cuyo tamaño se aproxime al del poro, verá impedido su avance respecto a aquellas cuyo tamaño sea muy inferior. Por esta razón, el soporte actúa como un cedazo que separa o tamiza las moléculas en función de su tamaño.

Bibliografia
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/Electroforesis/Electroforesis.html